Principi sinteze nukleinskih kiselina

Sinteza nukleinske kiseline provodi se metodom čvrste faze sijaličnog amida triglicerida, pri čemu se 3′ kraj DNK imobilizira na supstratu čvrste faze i dodaju se nukleotidi u smjeru 3′ do 5′ dok se ne sintetizira željeni fragment DNK .To se razlikuje od sinteze DNK primjenom DNK polimeraze.

3′ kraj prve baze je imobiliziran na CPG tokom sinteze, 5′-OH sljedeće baze je zaštićen di-p-tolil tritil DMT-om, amino grupa na bazi je zaštićena benzojevom kiselinom, a 3′ -OH se zatim aktivira amino fosfatnim spojem.1 baza 5 5′-OH 1 baze i 3′-OH sljedeće baze tvore fosfitni triglicerid, koji se zatim oksidira jodom do fosfatnog triglicerida, a zaštitno sredstvo na drugoj bazi 5′-OH uklanja se pomoću dodavanjem dihloroctene kiseline DM ciklusi kroz dodavanje sljedeće baze, a nakon sinteze, protektant na 5′-OH se uklanja slabom kiselinom. Fragment se odvaja od čvrste smole koncentrovanim amonijum hidroksidom, zaštitno sredstvo se uklanja sa baze sa koncentrovanim amonijum hidroksidom uz zagrevanje, amonijum hidroksid se uklanja, fragment se suši u vakuumu, a nukleinska kiselina se pročišćava tečnom hromatografijom ili PAGE.

Koraci oligo sinteze

Deblokiranje

The5-krajna DMT zaštitna grupa se uklanja dodavanjem TCA rastvora.

Aktivacija

Miješanje aktivatora sa oligonukleotidnim monomerom da se formira aktivni oligonukleotidni monomer intermedijer.

Spojnica

5-terminalna hidroksilna grupa reaguje sa aktivnim oligonukleotidnim intermedijerom u antigenerativnoj reakciji kondenzacije da bi se formirala nestabilna fosfitna trigliceridna veza.

Cappping 

Dodatak agensa za zatvaranje izvodi reakciju zatvaranja acetilacije sa viškom hidroksilnih grupa koje nisu uključene u reakciju kondenzacije.

Oksidacija 

Dodatak rastvora joda koji sadrži vodu reaguje sa nestabilnim fosfitnim vezama oksidacijom da bi se formirale stabilne trigliceridne veze fosforne kiseline.

Cianoethyl Cleavage

Produkt nukleinske kiseline nakon sinteze, uz dodatak otopine DEA za uklanjanje cijanoetilne grupe sa fosfatne trigliceridne veze.

Cleaved&Deprotection

Fragmenti nukleinske kiseline se odvajaju od nosača čvrste faze dodavanjem koncentrovanog rastvora amonijum hidroksida i zatim se zagrevaju da bi se uklonile zaštitne grupe sa vodoničnih veza baza.